Реактивы. Метод тонкослойной хроматографии

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

СОЮЗА ССР

РЕАКТИВЫ

МЕТОД ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

ГОСТ 28366-89

(СТ СЭВ 6398-88)

Издание официальное

го

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО УПРАВЛЕНИЮ

КАЧЕСТВОМ ПРОДУКЦИИ И СТАНДАРТАМ

М вс к в
а

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Реактивы
Метод тонкослойной хроматографии
Reagents. Method of thin-layer chromatography

ОКСТУ 2609

Дата введения 01,01.91
Несоблюдение стандарта преследуется по закону
Настоящий стандарт распространяется на химические реакти­вы и устанавливает метод проведения испытания, основанный на тонкослойной хроматографии.
Термины, применяемые в стандарте, и их определения приве­дены в приложении 2. Рекомендуемые области применения мето­да приведены в приложении 3.

1. ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ

1.1. При проведении испытаний должны быть соблюдены тре­бования ГОСТ 27025.
1.2. В нормативно-технической документации на испытуемый реактив должны быть указаны следующие данные:
1.2.1. Описание приготовления испытуемого раствора.
1.2.2. Предварительная обработка (при необходимости).
1.2.3. Используемые растворители (или смесь).
1.2.4. Применяемые реактивы и растворы.
1.2.5. Способ хроматографирования.
1.2.6. Тип хроматографической пластинки, материал и толщи­на слоя сорбента, тип сорбента, размер частиц, дополнительные данные о приготовлении сорбента, его активации, хранении (при необходимости).
1.2.7. Время насыщения хроматографической камеры парами подвижной фазы.
1.2.8. Объем испытуемого раствора, наносимый на пластинку.
1.2.9. Температура, при которой проводят хроматографирова­ние (при необходимости).
1.2.10. Критерии окончания процесса хроматографирования.
Издание официальное Перепечатка воспрещена
© Издательство стандартов, 1990
1.2.11. Способ проявления хроматограмм и реагенты для про­явления (при необходимости).
1.2.12. Способ оценки хроматограмм.
1.2.13. Вещества сравнения, используемые для оценки (при не­обходимости) .
1.2.14. Аппаратура для количественной оценки разделенных компонентов (при необходимости).

2. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

Метод заключается в разделении на тонком слое сорбента сме­си веществ в потоке растворителя, основанном на различной ско­рости перемещения компонентов смеси.

3. АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ

3.1. Камера (сосуд) хроматографическая, закрытая герметич­ной крышкой.
3.2. Микропипетка вместимостью 0,002—0,010 см3 или микро­шприц вместимостью не более 0,01 см3.
3.3. Пластинки хроматографические из стекла, пластмассы, алюминия с тонким слоем подходящих материалов, пригодных для хроматографирования (например силикагеля, кизельгура, оки­си алюминия, целлюлозы).
3.4. Аппарат для подготовки пластинок.
3.5. Пульверизатор.
3.6. Лампа ультрафиолетовая (для обнаружения веществ с ис­пользованием флуоресценции при длинах волн от 254 до 366 нм).
3.7. Денситометр.
3.8. Устройство для сканирования пятен на сорбенте.

4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

4.1. Приготовление пластинок для тонкослойной хроматографии
Предварительная очистка пластинок, размеры пластинок, тол­щина слоя сорбента, средний размер частиц сорбента или его тип, а также сушка, хранение пластинок и предварительное приготов­ление для испытания должны быть приведены в нормативно-тех­нической документации на испытуемый реактив. Пластинки гото­вят одним из способов, указанных ниже.
4.1.1. Разравнивание сухого материала на соответствующей подложке пластинки (насыпной способ).
4.1.2. Приготовление нанесением суспензии сорбента в смеси со связующим веществом или флуоресцентным индикатором на пластинку в соответствии с нормативно-технической документаци­ей на испытуемый реактив.
4.1.3. Применение готовых пластинок или готового набора плас­тинок, приготовленных в соответствии с инструкцией, приложен­ной к набору.
4.2. Нанесение пробы
В точки, отмеченные на линии старта, наносят с помощью ка­либрованной микропипетки или микрошприца 0,001—0,010 см3 ис­пытуемых растворов, если в нормативно-технической документа­ции на испытуемый реактив нет других указаний. При необходи­мости, в точки на линии старта наносят таким же образом раство­ры веществ, соответствующих предполагаемым компонентам сме­си, для идентификации и количественной оценки этих примесей. При нанесении пробы не должна быть нарушена целостность слоя сорбента. Оптимальный диаметр пятен нанесенных проб должен быть 3—5 мм. Допускается наносить пробу не в виде точки, а чертой с применением микропипетки или капилляра. На тонко­слойной пластинке отмечают высоту продвижения фронта подвижной фазы и записывают данные о каждой пробе, под­вижной фазе и дату анализа. При необходимости нанесения боль­ших объемов испытуемого раствора рекомендуется нанесение пя­тен хроматографическим шприцем, порциями по 0,001 см3 и под­сушивание пятна холодным воздухом.
После нанесения пробы растворителю дают свободно испа­риться.

5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

Хроматографическое разделение веществ проводят в хромато­графической камере, в замкнутой системе, насыщенной парами подвижной фазы. Если в нормативно-технической документации на испытуемый реактив нет других указаний, хроматографирова­ние проводят, как указано ниже.
Предварительно готовят подвижную фазу (элюирующую сис­тему), раствор пробы, а также растворы веществ сравнения или растворы предполагаемых примесей и элюирующую систему вво­дят в камеру.
Тонкослойную пластинку с нанесенной пробой и, при необхо­димости, с веществами сравнения или предполагаемыми примеся­ми после испарения растворителя при комнатной температуре по­мещают в камеру, насыщенную парами подвижной фазы, подвер­гают элюированию подвижной фазой. Элюируют до тех пор, пока фронт подвижной фазы не окажется на предварительно обозна­ченной высоте, примерно в 20—30 мм от верхнего края пластинки. Хроматографическую пластинку вынимают и сушат. После высу­шивания хроматограмму можно элюировать повторно или тем же самым растворителем (повторная хроматография) или другим растворителем (последовательная хроматография). Пластинку по- Г
мещают в растворитель стартом вниз или повернув ее под углом> 90° (метод двумерного разделения пятна испытуемой пробы).
5.1. Восходящая хроматография
Хроматографическую пластинку помещают в хроматографиче­скую камеру таким образом, чтобы ее нижний конец был погру­жен в слой подвижной фазы на дне сосуда, как показано на черт. 1 и черт. 2 приложения 1.
5.2. Горизонтальная хроматография
Испытание проводят, как показано на черт. 3 приложения 1.
5.3. Нисходящая хроматография
В камере для нисходящей хроматографии должен быть сосуд, в который помещают подвижную фазу. Подвешенную хроматогра­фическую пластинку соединяют (вблизи линии старта) бумажным фитилем с подвижной фазой сосуда, как показано на черт. 4 при­ложения 1.

6. СУШКА ХРОМАТОГРАММ

По окончании разделения хроматограмму вынимают из каме­ры, отмечают фронт мягким карандашом и сушат в таком поло­жении, как при элюировании, при комнатной температуре или в горячем воздухе (кроме пластинок, приготовленных насыпным способом, которые сушат в горизонтальном положении). Продол­жительность сушки зависит от скорости испарения подвижной фа­зы и химической стабильности хроматографируемых веществ.

7. ПРОЯВЛЕНИЕ ХРОМАТОГРАММ

Проявление компонентов на хроматограмме проводят одним из способов, приведенных ниже.
7.1. Физические методы
Визуально при дневном свете отмечают на хроматограмме по­ложение пятен цветных веществ. При наличии флуоресцирующих веществ проявление проводят в УФ-свете.
7.2. Химические методы
Хроматограмму проявляют жидкими и газообразными прояви­телями, используя реакцию имеющихся на хроматограмме соеди­нений с подходящим реагентом-проявителем с образованием ок­рашенного или флуоресцирующего вещества. Жидкие проявители наносят пульверизатором или используют реагенты в аэрозольной упаковке; газообразные проявители применяют, поместив хрома­тограмму в пары проявителя.
7.2.1. Хроматограмму кладут горизонтально на лист фильтро­вальной бумаги или оставляют в вертикальном положении и оп­рыскивают мелкими каплями (туманом) проявителя всю площадь хроматограммы.
7.2.2. При проявлении газообразным проявителем хромато­грамму подвешивают в камере, в которую помещен летучий реа­гент (например кристаллы йода), или на дне которой проявитель получают химическим путем (например оксиды азота получают путем добавления твердого нитрита натрия к раствору соляной кислоты).
7.3. Биологические методы
Хроматограмму проявляют, используя биологическую актив­ность хроматографируемых веществ.

8. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИСПЫТАНИЙ

8.1. Качественная оценка хроматограммы заключается в опре­делении положения пятна или полосы, которое характеризуется значением Rf:
где а — расстояние от центра пятна до стартовой линии, мм;
b — расстояние от фронта растворителя до стартовой линии» мм
или значением Rx:
Rx=—,
с
где с — расстояние от центра пятна вещества сравнения до стар­товой линии, мм.
8.2. Определение количества искомого компонента в пробе про­водят путем сравнения размеров и интенсивности окраски его пят­на с пятнами вещества сравнения, нанесенными на хроматогра­фическую пластинку в интервале значений концентрации, указан­ных в нормативно-технической документации на испытуемый реак­тив, и обработанными в условиях испытания. Оценку проводят визуально или с помощью аппаратуры (например денситометра, устройства для сканирования пятен компонентов на пластинке) или путем элюирования пятен и последующего 'фотометрического определения оптической плотности растворов.
8.3. Хроматограммы хранят в условиях, препятствующих появ­лению взаимных оттисков хроматограмм (например с прокладка­ми из фильтровальной бумаги).
Если характер пятен позволяет, то на хроматограммы наносят слой быстросохнущего лака. В случае необходимости проводят за­рисовку контуров хроматограммы или фотографирование.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Справочное

ПРИМЕРЫ ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Камера для восходящей
хроматографии
Черт. 2
Камера для
горизонтальной
хроматографии

/—хроматографическая камера; 2— хроматограмма
(сорбентом вниз); 3—фильтровальная бумага; 4—раство-
ритель; 5—стеклянная палочка
Черт. 3
Камера для нисходяще*
хроматографии
(проточн