ГОСТ 28560-90
Завантажити документ
Формат .docx · доступно зареєстрованим користувачам
Группа Н09
Метод выявления бактерий родов
Proteus, Morganella, Providencia
Food products. Method for detection of bacteria
of Proteus, Morganella, Providencia genera
Срок действия с 01.07.91
до 01.07.96*
________________________________
* Ограничение срока действия снято
по протоколу N 5-94 Межгосударственного Совета
по стандартизации, метрологии и сертификации
(ИУС N 11-12, 1994 год).
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности
В.И.Рогачев, д-р техн. наук; Б.И.Голод, канд. биол. наук; Р.А.Волкова
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 24.05.90 N 1277
3. Срок первой проверки - 1996 г.
Периодичность проверки - 5 лет
Обозначение НТД, на который дана ссылка
Номер раздела, пункта
2
2, 3.1.11, 3.2.1, 3.2.2
2
1
1, 5.1
3.2.4, 3.2.8
________________
* Действует действует ГОСТ 24104-2001, здесь и далее по тексту.
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia.
Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведений в жидкую селективную среду, культивировании посевов при (36±1) °С в течение 48 ч, последующем пересеве выросших культур на плотные дифференциально-диагностические среды, культивировании посевов при (36±1) °С в течение 48 ч, выделении характерных колоний и подтверждении с помощью биохимических тестов их принадлежности к бактериям родов Proteus и (или) Morganella и (или) Providencia или к видам Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.
Отбор проб - по ГОСТ 26668, подготовка к испытанию - по ГОСТ 26669.
Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ±2 мг (для взвешивания реактивов);
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ±10 мг (для взвешивания продукта);
микроскоп световой биологический по ГОСТ 8284 или импортный с аналогичными техническими характеристиками;
термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 °С;
холодильник бытовой;
стерилизатор горячим воздухом;
адонит;
мальтоза;
метил бутанол (амиловый спирт);
мочевина;
нейтральный красный;
натрия дезоксихолат;
O);
натрий аммония фосфат;
полимиксин В сульфат во флаконах по 25 мг (250000 ЕД) и по 50 мг (500000 ЕД);
полимиксин М сульфат во флаконах по 500000 ЕД;
L - или DL-фенилаланин;
L - или DL-орнитин;
феноловый красный;
желчь сухая или желчь натуральная крупного рогатого скота;
железа (III) цитрат;
O)
3.1. Приготовление растворов
и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
, растворяют в дистиллированной воде, раствор доливают до метки.
. Раствор доливают раствором гидроксида натрия до метки.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки и выдерживают на водяной бане при (60±1) °С в течение 1 ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки и выдерживают на водяной бане при (60±1) °С в течение 1 ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 6 мес.
стерильной дистиллированной воды.
3.1.10. Реактивы для определения индола:
).
).
Реактивы хранят в сосудах из темного стекла при температуре (4±2) °C не более 1 мес.
3.1.11. Вазелиновое масло готовят по ГОСТ 10444.1.
и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
3.2. Приготовление питательных сред
3.2.1. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.2. Бульон мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.
спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по п.3.1.1. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (6,9±0,1) при 25 °С. Стерилизуют текучим паром при 100 °С в течение 15 мин.
. Хранят при (4±2) °С не более 7 сут. Готовая среда прозрачная, желто-бурого цвета.
3.2.4. Агар дезоксихолат-цитрат лактозный по Leifson модификация Hynes.
кипящей мясной воды, приготовленной по ГОСТ 10444.1, растворяют 5,0 г пептона, 10,0 г лактозы, 22,5 г агара, охлаждают до (45-50) °С, устанавливают рН таким образом, чтобы при 25 °С он составлял (7,4±0,1). Прибавляют 0,03 г нейтрального красного, разливают в мерные колбы, стерилизуют при (115±1) °С в течение 20 мин. Хранят при (4±2) °С не более 7 сут.
мясо-пептонного бульона, приготовленного по п.3.2.2.
раствора дезоксихолата натрия, приготовленного по п.3.1.8. Среду перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри по ГОСТ 26670. Среду используют в день ее приготовления.
дрожжевого экстракта, 10,0 г пептона, 10,0 г лактозы, 10,0 г сахарозы, 1,0 г глюкозы, 0,3 г железа (III) цитрата, 0,3 г натрия тиосульфата, 0,024 г фенолового красного, 15,0 г агара. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,4±0,1). Разливают в пробирки и стерилизуют при (121±1) °С в течение 10 мин, дают застыть в наклонном положении, чтобы максимальная высота столбика составляла 2,5 см. Среда имеет коричнево-красную окраску. Хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
среды разливают в пробирки, стерилизуют при (121±1) °С 10 мин, дают застыть в наклонном положении. Среду хранят при (4±2) °С не более 7 сут.
кипящей дистиллированной воды. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,0±0,1). Стерилизуют при (121±1) °С в течение 15 мин и дают застыть в пробирках в наклонном положении. Среда имеет зеленую окраску, ее хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
щелочного раствора фенолового красного, приготовленного по п.3.1.3, раствор антибиотика, приготовленного по п.3.1.9 и содержащего 120000 ЕД полимиксина М сульфата или 100000 ЕД полимиксин В сульфата. Среду стерилизуют текучим паром (при 100 °С) в течение 15 мин и разливают по ГОСТ 26670 после охлаждения по стерильным чашкам Петри. Среду хранят при (4±2) °С не более 7 сут. Готовая среда оранжево-красного цвета.
в пробирки, стерилизуют при (121±1) °С в течение 15 мин. Среду используют в день приготовления.
3.2.10. Среда для определения декарбоксилазы орнитина:
и стерилизуют при (121±1) °С в течение 10 мин. Хранят при (4±2) °С не более 7 сут. Готовая среда светло-фиолетового цвета.
4.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить предполагаемое минимальное количество продукта, содержащее бактерии родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.
в жидкую селективную среду по п.3.2.3. Посевы инкубируют при (36±1) °С в течение 48 ч.
4.3. Положительными считают пробирки, в которых наблюдается помутнение среды. При росте бактерий, расщепляющих мочевину, наблюдается изменение цвета среды в синий. Отсутствие изменения цвета среды не является показателем отсутствия роста выявляемых бактерий.
4.4. Для подтверждения присутствия бактерий родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis из всех пробирок, в которых наблюдается помутнение среды, делают пересевы на одну из дифференциально-диагностических плотных сред, приготовленных по п.3.2.4 или по п.3.2.8, таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний.
Посевы инкубируют при (36±1) °С в течение 48 ч.
4.5. На дифференциально-диагностических плотных средах бактерии образуют колонии круглой формы диаметром 1-3 мм. Бактерии рода Proteus обладают свойством роения (ползучим ростом).
4.6. Из всех чашек с характерным ростом выбирают не менее 5 колоний для выделения чистых культур и дальнейшего изучения.
Для получения чистых культур используют скошенный в пробирке мясо-пептонный агар по п.3.2.1 или мясо-пептонный бульон по п.3.2.2. Посевы инкубируют при (36±1) °С в течение 24 ч.
4.7. Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных микроорганизмов к бактериям родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia.
4.7.1. Для определения наличия дезаминазы фенилаланина из 24-часовой культуры по п.4.6 делают высев штрихами на поверхность скошенного в пробирке агара, приготовленного по п.3.2.6, и культивируют при (36±1) °С в течение 48 ч, после этого на поверхность агара пипеткой наносят 3-5 капель раствора хлорного железа, приготовленного по п.3.1.4. При этом появление интенсивной зеленой окраски среды свидетельствует о положительной реакции. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.
Бактерии родов Proteus, Morganella, Providencia дают положительную реакцию.
4.7.2. Для определения способности образовывать сероводород культуры по п. 4.6 высевают методом укола в столбик и штрихами по поверхности агаризованной среды, приготовленной по п.3.2.5.
Посевы инкубируют при (36±1) °С в течение 48 ч. При образовании сероводорода столбик среды чернеет. Бактерии рода Proteus образуют сероводород, при этом в столбике среды появляется газ, что указывает на ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа.
Допускается инкубирование посевов при отсутствии сероводорода через 48 ч продолжать до 4 сут, так как Р.myxofaciens может образовывать сероводород на 3-и - 4-е сутки. Бактерии рода Morganella и Providencia сероводорода не образуют.
4.7.3.