Продукты пищевые. метод выявления и определения количества энтерококков

Группа Н09

М Е Ж ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод выявления и определения количества энтерококков
Food products. Method for detection and determination of count
Enterococci
МКС 07.100.30

ОКСТУ 9109

Дата введения 01.07.91
Настоящий стандарт распространяется иа пищевые продукты и устанавливает метод выявления и количественного определения энтерококков (Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Strepto­coccus avium, Streptococcus gallinarum).
Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведении в жидкую селективную среду или на поверхность плотной селективной среды, аэробном культивировании посевов при (37 ± 1) °С в течение 24—48 ч, подтверждении принадлежности выросших микроорга­низмов к энтерококкам, пересчете их количества на 1,0 г (см3) продукта.

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Отбор проб — по ГОСТ 26668, подготовка к испытанию — по ГОСТ 26669.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Для проведения испытан ия применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:
весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104*, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешнос­ти ± 2 мг (для взвешивания реактивов);
весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ± 10 мг (для взвешивания продукта);
микроскоп световой биологический с увеличением в 900—1000 раз;
стерилизатор горячим воздухом;
термостат с диапазоном рабочих температур от 28 °С до 55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ± 1 °С;
холодильник бытовой;
водорода пероксид по ГОСТ 10929;
.f/l&AzJJ'di. Лэ jr-ImCi.*. kJ J/CXJ. tiJ.Aj.IXj CdKAJ J. d» лййіад/J-tLoj
железо (Ш) — аммония гидроцитрат;
ферментативный гидролизат казеина;
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104—2001 (здесь и далее).
Перепечатка воспрещена

С. 2 ГОСТ 28566-90

канамицин сульфат во флаконах по 0,5 г — 500 000 ЕД и 1 г — 1 000 000 ЕД, в ампулах по 5 и 10 см3 5 % раствора, содержащих 0,25 и 0,5 г препарата;
полимиксин М сульфат во флаконах по 500 000 ЕД;
эскулин;
натрия гидрокарбонат (NaHCO3) по ГОСТ 4201.

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1. Приготовление растворов
3.1.1. Раствор с объемной долей пероксида водорода 10 %:
33,3 см3 пероксида водорода с содержанием основного вещества 30 % (в случае если пероксид водорода имеет другое содержание основного вещества, то делается пересчет) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки.
3.1.2. Раствор с массовой долей НС1 5 %:11,5 см концентрированной соляной кислоты пере­носят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки.
3.1.3. Раствор массовой концентрацией натрия гидроксида 50 г/дм3: 5 г натрия гидроксида переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.
3.1.4. Раствор 2-, 3 -, 5 -трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) массовой концентрацией 10 г/дм3:1 г ТТХ переносят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильт­рации по ГОСТ 26670. В земной плотно закрытой посуде раствор хранят при (4 ± 2) 6С не более З мес.
3.1.5. Раствор массовой концентрацией теллурита калия 20 г/дм3: 2 г теллурита калия перено­сят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем дистил­лированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.
3.1.6. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм3: 1,6 г бромтимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
3.1.7. Раствор массовой концентрацией кристаллического фиолетового 0,1 г/дм3: 0,01 г крис­таллического фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в дистил­лированной воде. Раствор доливают до метки.
3.1.8. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового ПурПурНОГО jg г/дм3: 1,6 г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
3.1.9. Раствор массовой концентрацией натрия азида 100 г/дм3: 10 г натрия азида переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют при легком подогревании в дистиллированной воде и раствор доливают до метки. Раствор готовят под вытяжкой, так как пары натрия азида ядовиты.
3.1.10. Раствор массовой концентрацией канамицина сульфата 50 г/дм3 (50 000 000 ЕД) и 100 г/дм3 (100 000 000 ЕД): во флаконы с 0,5 г или 1 г препарата вносят 10 см3 стерильной дистил­лированной воды, содержимое флаконов растворяют.
3.1.11. Молоко обезжиренное готовят по ГОСТ 10444.1.
3.1.12. Растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2. Приготовление питательных сред
3.2.1. Азидно-глюкозный бульон
Основа среды: к 1 дм3 мясопептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, добавляют 5,0 г пептона, 7,5 г глюкозы, 2,5 г натрия хлорида, составные части растворяют нагреванием. После этого охлаждают и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации при 25 °С он составлял 7,2 ± 0,1. Затем основу среды стерилизуют текучим паром (при 100 °С) в течение 30 мин. К основе среды, охлажденной до 50 еС, добавляют 2,0 см3 натрия азида, приготовленного по п. 3.1.9, и 2,0 см3 раствора бромкрезолового пурпурного, приготовленного по п. 3,1.8. Готовую среду не стерилизуют. Среду хранят в защищенном от света и высыхания вице при (4 ± 2) вС не более 3 мес. Непосредственно перед использованием ее разливают по 5 см3 в стерильные пробирки.
3.2.2. Глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH 7,2 и 9,6:5,0 г триптона или ферментативного казеинового гидролизата, 12,5 см3 дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы добавляют
50

ГОСТ 28566-90 С. 3

к 1 дм3 дистиллированной воды. Смесь, периодически помешивая, подогревают до полного раство­рения всех составных частей, охлаждают и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерили­зации он составлял при 25 °С 7,2 ± 0,1 или 9,6 ± 0,1.
Среду разливают по 5 см3 в пробирки и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение 15 мин. Среду хранят при (4 ± 2) °С не более 14 сут.
3.2.3. Салевой бульон
Основа среды — глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH 7,2 ±0,1 по п. 3.2.2.
При приготовлении питательной среды в 1 дм3 основы среды растворяют на водяной бане 65,0 г натрия хлорида, разливают по 5 см3 в пробирки, стерилизуют при (121 ± 1) °С в течение 15 мин.
Питательную среду можно готовить за одну операцию, тогда в процессе приготовления основы среды добавляют 65,0 г натрия хлорида. Среду хранят при (4 ± 2) °С не более месяца.
3.2.4. 40 %-ный желчный бульон
Основа среды — глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH 7,2 ± 0,1. К 600 см3 охлажденной до 45 С—55 °С основы среды добавляют асептически 400 см3 стерильной профильтрованной желчи крупного рогатого скота или эквивалентное количество сухой желчи.
Среду хранят при (4 ± 2) °С не более 3 мес.
3.2.5. Селективный агар по Сланецу и Бертли:
20,0 г пептона, 25,0 см3 дрожжевого экстракта, 2,0 г глюкозы, 4,0 г калия фосфорнокислого двузамещенного, (15,0 ± 3,0) г агара помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доливают дистиллированной водой до метки, нагревают до растворения компонентов. Охлаждают, устанавли­вают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С 7,2 ± 0,1. Стерилизуют текучим паром (при 100 °С) в течение 30 мин, охлаждают до 50 °С. Добавляют 4,0 см3 раствора азида натрия, приготовленного по п. 3.1.9, и 10,0 см3 раствора 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида, приготовленного по п. 3.1.4, хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (4 ± 2) °С не более 7 сут.
3.2.6. Канамицин азидно-эскулиновый агар (КАЭ-агар):
20,0 г пептона из казеина, 25,0 см3 дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,5 г железа (III) — аммония гидроцитрата, 1,0 г эскулина, (15,0 ± 3,0) г агара помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доливают дистиллированной водой до метки. Растворяют составные части при нагревании, охлаждают, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации при 25 °С он составлял 7,1 ± 0,1. Стерилизуют при (121 ± 1) °С в течение 15 мин, охлаждают до 50 °С, добавляют 1,5 см3 раствора азида натрия, приготовленного по п. 3.1.9, и 0,4 см3 раствора канамицина сульфата массовой концентрацией 50 г/дм3 или 0,2 см3 раствора канамицин сульфата массовой концентрацией 100 г/дм3 и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (4 ± 2) °С не более 7 сут.
3.2.7. Глюкозо-триптонный агар с дрожжевым экстрактом с pH 7,2 ± 0,1 готовят по п. 3.2.2, но при приготовлении добавляют на 1 дм3 среды (15,0 ± 3,0) г агара.
3.2.8. Щелочная полимиксиновая среда:
Основа среды —к 400 см3 мясо-пептонного бульона по ГОСТ 10444.1 добавляют 5 г натрия хлорида, 10 г глюкозы, 10 см3 дрожжевого экстракта. Основу среды стерилизуют при (ПО ± 1) °С в течение 12 мин, охлаждают и добавляют 250 см3 раствора натрия карбоната массовой концентра­цией 21,2 г/дм3 и 250 см3 раствора бикарбоната натрия массовой концентрацией 10 г/дм3. Устанав­ливают pH таким образом, чтобы при 25 °С он составлял 10,1 ± 0,1. После этого к среде добавляют 200 000 ЕД полимиксина М сульфата, 5,0 см3 спиртового раствора бромтимолового синего, приго­товленного по п. 3.1.6. Среду хранят в защищенном от света и высыхания виде при (4 ± 2) °С не более 7 сут. Непосредственно перед использованием среду разливают по 5 см3 в стерильные про­бирки.
3.2.9. Молочно-ингибиторная среда (МИС):
К 850 см3 расплавленного и охлажденного до 50 °С мясо-пептонного агара, приготовленного по ГОСТ 10444.1, добавляют 150 см3 обезжиренного молока, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 12,5 см3 раствора кристаллического фиолетового, приготовлен