ГОСТ 29185-91
Завантажити документ
Формат .docx · доступно зареєстрованим користувачам
Группа Н09
Методы выявления и определения количества
сульфитредуцирующих клостридий
Food products. Methods for detection and
quantity determination of sulphite-reducing clostridium
Дата введения 1993-01-01
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП), ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"
В.И.Рогачев, д-р техн. наук; Б.И.Голод, канд. биолог. наук; А.Я.Козелькин, Р.А.Волкова; Н.В.Бурыченко
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 23.12.91 N 2050
3. Срок проверки - 1977 г.; периодичность проверки - 5 лет
4. Настоящий стандарт соответствует ИСО 7937-85 в части выявления колоний, характерных для сульфитредуцирующих микроорганизмов
Обозначение НТД, на который дана ссылка
Номер пункта
2
2
2; 3.1.8; 3.1.9; 3.1.10; 3.2.1; 3.2.2; 3.2.3;
3.2.4; 3.2.7; 3.2.9
4.7.1; 4.7.2
4.3; 4.6; 4.7.3
3.2.6
2
1
1; 4.1.1
3.1.7; 4.1.4; 5.5; 5.7
5.6
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта сульфитредуцирующих клостридий и два метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и метод посева в агаризованную среду.
Методы основаны на высеве определенного количества продукта и (или) его разведений в железосульфитсодержащие среды, инкубировании посевов при (37±1) °С не более 72 ч, подтверждении принадлежности выросших микроорганизмов по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам к сульфитредуцирующим клостридиям.
более 15 сульфитредуцирующих клостридий.
более 3 сульфитредуцирующих клостридий.
Требования настоящего стандарта являются обязательными.
Отбор и подготовка проб пищевых продуктов - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.
Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ±2 мг (для взвешивания реактивов);
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 24104-2001, здесь и далее по тексту.
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ±10 мг (для взвешивания продукта);
:
стекла предметные по ГОСТ 9284;
стекла покровные по ГОСТ 6672;
О);
;
О).
3.1. Приготовление растворов и реактивов
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки. При использовании соли в виде кристаллогидратов проводят соответствующий пересчет на безводную соль.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.
3.1.6. Растворы, приготовленные по пп.3.1.1-3.1.5, стерилизуют текучим паром в течение 1 ч.
, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670*.
_________________
* Действует ГОСТ 26670-91, здесь и далее по тексту.
3.1.8. Растворы и реактивы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.
3.1.9. Растворы и реактивы для окраски бактериальных спор готовят по ГОСТ 10444.1.
3.1.10. Реактив для определения каталазы готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2. Приготовление питательных сред
3.2.1. Голодный агар готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.2. Мясную воду готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.3. Мясо-пептонный агар (бульон) с 0,1% глюкозы и дрожжевым экстрактом готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.4. Среду из сухого питательного агара с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1.
или колбы и стерилизуют при (121±1) °С в течение 15 мин.
мясной воды, приготовленной по п.3.2.2.
3.2.6. Триптозо-сульфит-циклосериновый агар готовят по ГОСТ 10444.9.
.
раствора аммония железа (III) сульфата, приготовленного по п.3.1.2. Среду хранят в защищенном от света месте при (6±2) °С не более 7 сут.
.
.
мясо-пептонного бульона с 0,1% глюкозы и дрожжевым экстрактом, приготовленным по п.3.2.3, добавляют 1,5 г агара. Нагревают до расплавления агара, затем охлаждают до (50±5) °С. Устанавливают рН среды таким образом, чтобы он соответствовал (7,1±0,1) (в пересчете на (25±1) °С). Среду разливают мерно в колбы и стерилизуют при (121±1) °С в течение 20 мин, затем к среде добавляют растворы, указанные в п.3.2.8, для определения сульфитредуцирующей способности.
раствора железа треххлористого, приготовленного по п.3.1.4. В этом случае готовая среда не подлежит хранению.
3.2.9. Среду Китт-Тароцци без добавления агара, вазелинового масла готовят по ГОСТ 10444.1.
4.1. Определение количества сульфитредуцирующих клостридий
) предполагаемое количество сульфитредуцирующих клостридий или их количество, указанное в нормативно-технической документации на конкретный продукт.
таким образом, чтобы, анализируемая проба не размазывалась по стенкам колбы.
исходного разведения или продукта и термометр.
Время термообработки начинают отсчитывать с того момента, когда содержащееся в колбе исходное разведение или продукт достигнут указанной температуры. После термообработки колбу немедленно охлаждают под струей водопроводной воды.
4.1.3. При определении количества сульфитредуцирующих клостридий по методу НВЧ высевают три последовательных навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся друг от друга по количеству высеваемого продукта в 10 раз. Каждую навеску продукта и (или) его разведение высевают в пробирки с одной из вязких питательных сред, приготовленных по п.3.2.5 или 3.2.7, или 3.2.8.1, или 3.2.8.2. Соотношение количества высеваемого продукта или его разведения к питательной среде 1:9.
навески продукта или его разведения вносят в две чашки Петри. Посевы заливают по ГОСТ 26670 одной из агаризованных сред, приготовленных по п.3.2.5 или 3.2.7, или 3.2.8, или 3.2.8.2, или 3.2.6.
голодного агара.
4.2. Определение присутствия (отсутствия) сульфитредуцирующих клостридий
При определении присутствия (отсутствия) сульфитредуцирующих клостридий в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску или разведение вносят в одну из вязких питательных сред, приготовленных по п.3.2.5 или 3.2.7, или 3.2.8.1, или 3.2.8.2.
4.3. Посевы по пп.4.1.3, 4.1.4 и 4.2 инкубируют при (37±1) °С не более 72 ч. Посевы на чашках Петри инкубируют в анаэробных условиях по ГОСТ 10444.4*. Ежедневно посевы просматривают для обнаружения признаков роста сульфитредуцирующих микроорганизмов - почернения сульфитной среды.
_________________
* Действует ГОСТ 30425-97, здесь и далее по тексту.
4.4. Из посевов в вязкие среды отбирают пробирки с признаками роста - отдельными черными колониями или полностью почерневшей питательной средой на глубине свыше 1 см. Из отобранных пробирок проводят пересевы петлей в чашки Петри на поверхность одной из агаризованных сред, приготовленных по п.3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.7, или 3.2.8, или 3.2.8.2 так, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы инкубируют в анаэробных условиях при (37±1) °С в течение 24-48 ч.
4.5. Из посевов на агаризованные среды (см. п.4.1.4) отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний.
4.6. Не менее 5 овальных черных или окруженных черным или серым ореолом колоний диаметром 4-5 мм, отобранных по п.4.4 или 4.5, высевают раздельно в свежерегенерированную по ГОСТ 10444.4 среду, приготовленную по п.3.2.9.
Посевы инкубируют при (37±1) °С не более 48 ч.
4.7. Подтверждение принадлежности выделенных сульфитредуцирующих микроорганизмов к роду Clostridium
4.7.1. Микроскопирование
Из культур, выросших, как указано в п.4.6, готовят два препарата и окрашивают по ГОСТ 10444.3*, первый - по Граму, второй - для выявления бактериальных спор.
_________________
* Действует ГОСТ 30425-97, здесь и далее по тексту.
Сульфитредуцирующие клостридии представляют собой грамположительные палочки, располагающиеся в одиночку, попарно, в виде цепочек или скоплений параллельных клеток. При спорообразовании споры сульфитредуцирующих клостридий овальные или сферические, субтерминальные или терминальные.
4.7.2. Определение отсутствия каталазы
Отсутствие каталазы в культурах, выросших, как указано в п.4.6, определяют по ГОСТ 10444.3.
Сульфитредуцирующие клостридии каталазу не образуют.
4.7.3. Подтверждение анаэробного роста
Подтверждение анаэробного роста проводят посевом по ГОСТ 10444.4 культур, выросших, как указано в п.4.6, в чашки Петри под стекло или в трубки Вейона. Для посева используют одну из агаризованных питательных сред, приготовленных по п.3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.7, или 3.2.8, или 3.2.8.2. Посевы инкубируют в аэробных условиях при (37±1) °С в течение 18-72 ч.
Для сульфитредуцирующих клостридий характерен анаэробный рост.
Допускается взамен подтверждения анаэробного роста проводить определение отсутствия роста в аэробных условиях. При этом культуры высевают в чашки Петри на поверхность агаризованной среды.
Посевы инкубируют в аэробных условиях при (37±1) °С в течение 18-72 ч.
5.1. Результаты испытания оценивают по каждой пробе отдельно.
5.2. Если при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств обнаружены сульфитредуцирующие грамположительные, каталазоотрицательные, способные расти в анаэробных условиях микроорганизмы, то дают заключение о том, что эти микроорганизмы относятся к сульфитредуцирующим клостридиям.
5.3. Если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост сульфитредуцирующих клостридий, то считают, что все хар