Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I - IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами

Про затвердження державних санітарних норм і правил "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I - IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами"
Наказ Міністерства охорони здоров'я України
від 24 січня 2008 року N 26
Зареєстровано в Міністерстві юстиції України
7 лютого 2008 р. за N 88/14779
На виконання Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" НАКАЗУЮ:
1. Затвердити державні санітарні норми і правила "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I - IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами" (далі - Правила), що додаються.
2. Заступникам головного державного санітарного лікаря України, головному лікарю Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України, головному державному санітарному лікарю Автономної Республіки Крим, головним державним санітарним лікарям областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті, Міністерства оборони України, Міністерства внутрішніх справ України, Служби безпеки України, Адміністрації Державної прикордонної служби України, Державного департаменту України з питань виконання покарань, Державного управління справами України, об'єктів з особливим режимом роботи:
2.1. Прийняти затверджені цим наказом Правила до керівництва та використання при здійсненні державного санітарно-епідеміологічного нагляду;
2.2. Довести Правила до відома органів державної влади, підвідомчих установ державної санітарно-епідеміологічної служби, місцевих державних адміністрацій для використання у практичній діяльності.
3. Директору Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренку А. М. забезпечити реєстрацію цього наказу в Міністерстві юстиції України.
4. Скасувати наказ МОЗ України від 24.12.2007 N 852 "Про затвердження державних санітарних норм і правил "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I - IV груп патогенності, молекулярно-генетичними методами".
5. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренка А. М.
 
Перший заступник Міністра,
головний державний санітарний
лікар України   
 
М. Г. Проданчук 

ЗАТВЕРДЖЕНО

наказом Міністерства охорони здоров'я України
від 24 січня 2008 р. N 26
Зареєстровано
в Міністерстві юстиції України
7 лютого 2008 р. за N 88/14779 

ДЕРЖАВНІ САНІТАРНІ НОРМИ І ПРАВИЛА

"Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I - IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами"
1. Загальні положення
1.1. Державні санітарні норми і правила "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I - IV груп патогенності, молекулярно-генетичними методами" (далі - Правила), розроблені на підставі Законів України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення", "Про захист населення від інфекційних хвороб" та постанови Кабінету Міністрів України від 22.06.99 N 1109 "Про затвердження Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні".
1.2. Правила встановлюють вимоги до приміщень лабораторій і порядку організації і проведення в них робіт з патогенними біологічними агентами (далі - БПА) I - IV груп патогенності або матеріалом, підозрюваним на їх вміст, з використанням молекулярно-генетичних методів, заснованих на полімеразній ланцюговій реакції (далі - ПЛР).
1.3. Правила регламентують виконання досліджень методом ПЛР із застосуванням обладнання, реагентів, тест-систем, дозволених до використання на території України відповідно до наказу МОЗ України від 04.08.2005 N 393 "Про затвердження Переліку медичних виробів, що підлягають державній реєстрації (перереєстрації) в Україні", зареєстрованому в Міністерстві юстиції України 19.10.2005 за N 1229/11509.
1.4. Правила поширюються на лабораторії (відділи, відділення) мікробіологічного профілю установ охорони здоров'я (далі - лабораторії), закладів науки та освіти, спеціалізовані лабораторії незалежно від їх підпорядкування та форм власності, що проводять молекулярно-генетичні дослідження з БПА I - IV груп патогенності або матеріалом, підозрюваним на їх вміст, дослідження з контролю об'єктів довкілля, харчових продуктів та продовольчої сировини за показниками безпеки, а також на наявність генетично-модифікованих джерел (далі - ПЛР-лабораторії).
1.5. Контроль за виконанням цих Правил здійснює Державна санітарно-епідеміологічна служба України.
1.6. В основі ПЛР лежить багатократне копіювання певного фрагмента дезоксирибонуклеїнової кислоти (далі - ДНК) за допомогою ферменту термостабільної ДНК-полімерази та специфічних праймерів. ПЛР дозволяє виявити специфічну ділянку генома біологічного агента.
1.7. Метод ПЛР має високу чутливість, специфічність, забезпечує можливість роботи практично з будь-яким видом біологічного матеріалу, пробами з об'єктів довкілля, включаючи харчові продукти, є експрес-методом, який дозволяє виконувати аналіз протягом 4 - 8 годин.
Специфічність ПЛР визначається здатністю праймерів точно "розпізнавати" певну ділянку нуклеїнової кислоти (далі - НК) і зв'язуватися з нею за принципом компліментарності.
Аналітична чутливість тест-систем для виявлення НК мікроорганізмів методом ПЛР становить 1 х 102 - 1 х 104 мікробних клітин (геномеквівалентів/мл), специфічність - 85 - 100 %.
1.8. За способом детекції продуктів ампліфікації розрізняють декілька форматів реакції:
- класичний (облік результатів реакції за допомогою електрофорезу);
- ПЛР з детекцією за допомогою гібридизаційно-імуноферментного аналізу (далі - ГІФА);
- ПЛР з флуоресцентною детекцією у "кінцевій точці" (після закінчення реакції);
- ПЛР з флуоресцентною детекцією у режимі "реального часу" (Real-Time PCR).
1.8.1. При використанні ПЛР в класичному форматі детекцію ампліконів здійснюють за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Результат детекції фотографують або сканують і архівують в пам'яті комп'ютера. Метод не передбачає кількісного визначення.
1.8.2. ПЛР з детекцією ГІФА виконується за допомогою специфічних тест-систем з внутрішніми ДНК-зондами. Метод дозволяє в ряді випадків значно підвищити чутливість і специфічність детекції ПЛР-продуктів.
1.8.3. ПЛР з флуоресцентною детекцією у "кінцевій точці" дозволяє реєструвати результат ампліфікації за допомогою детекторів типу "Джин" або "Ала 1/4" після закінчення реакції ("end-point detection") не відкриваючи пробірок. Цей метод також не є кількісним.
1.8.4. Для ПЛР у "реальному часі" також використовують флуоресцентно мічені олігонуклеотидні зонди. Цей метод дозволяє проводити моніторинг і кількісний аналіз накопичення продуктів реакції, оскільки кінетика накопичення пов'язана із вихідною кількістю матриці НК. Використання математичних методів аналізу результатів дослідження дозволяє автоматизувати їх інтерпретацію, тим самим зняти проблему суб'єктивної оцінки результатів електрофореграм.
1.8.5. У практичних лабораторіях, крім ПЛР, може використовуватись метод виявлення НК, заснований на одночасному застосуванні трьох ферментів: зворотної транскриптази, РНК-ази та РНК-полімерази Т7 - NASBA (Nucleic Acids Sequence Based Amplification) у "реальному часі". На відміну від ампліфікації в ПЛР, NASBA є ізотермічною реакцією, яка здійснюється при температурі +41° C.
Принцип цієї ізотермічної реакції ампліфікації полягає у тому, що під час ампліфікації відбувається збільшення кількості рибонуклеїнової кислоти (далі - РНК), яка транскрибується з спеціального промотора (РНК-полімерази Т7), що входить до складу специфічного праймера. Для добудовування другого ланцюга ДНК після першого етапу (зворотної транскрипції) використовується фермент РНК-залежна ДНК-полімераза (зворотна транскриптаза), яка має також і активність РНК-ази. Завдяки цій активності видаляється матрична РНК після синтезу першого ланцюга ДНК, отже, відбувається процес "денатурації" ДНК-РНК гібриду (за рахунок гідролізу РНК) автоматично відтворюваним в кожному подальшому циклі ампліфікації. Фермент ДНК-залежна РНК-полімераза транскрибує за один цикл (5 - 15 хвилин) 105 копій фрагментів РНК. Таким чином, протягом 40 - 50 хвилин ізотермічної транскрипційно опосередкованої ампліфікації ДНК або РНК в розчині утворюється 108 - 109 копій. В даний час принцип NASBA використовується у діагностичних наборах, виробництва "Organon Technika", "BioMerieux", "AmpliSens".
1.9. ПЛР використовують як експрес-метод діагностики інфекційних хвороб, індикації БПА в пробах з об'єктів довкілля та продуктах харчування, для визначення епідемічної значимості збудника на підставі виявлення генетичних маркерів вірулентності, визначення молекулярних механізмів резистентності мікроорганізмів до антимікробних засобів, для здійснення епідеміологічного нагляду за інфекційними хворобами, для верифікації сумнівних результатів діагностичних досліджень іншими методами, виявлення модифікованої НК в харчових продуктах, а також у наукових цілях.
1.10. Проведення досліджень методом ПЛР або NASBA вимагає дотримання правил біологічної безпеки, а також певних вимог до організації і проведення аналізу з метою запобігання контамінації досліджуваних проб НК та продуктами ампліфікації і отримання, в наслідок цього, хибнопозитивних або хибнонегативних результатів.
2. Терміни та визначення
У цих Правилах застосовуються такі терміни, визначення та скорочення:
Ампліфікація - процес багатократного примноження (копіювання) специфічної ділянки ДНК (кДНК) обмеженого (фланкованого) праймерами.
Амплікони - продукти ПЛР, що синтезуються в процесі ампліфікації ДНК-матриці.
Аліквота - (aliquot quantity) - певний, точно виміряний об'єм речовини, що є частиною цілого.
Біологічні патогенні агенти - патогенні для людини мікроорганізми (бактерії, віруси, хламідії, рикетсії, найпростіші, гриби, мікоплазми), генно-інженерно-модифіковані мікроорганізми, отрути біологічного походження (токсини), гельмінти, а також будь-які об'єкти і матеріал